由于社会经济发展迅速,各种类型的污染产生的复合效应加剧了我国水环境生态的风险。在我国城市化程度较高的地区,从饮用水和污水中都检测出不同类型的新兴污染物,如持久性有机物、内分泌干扰物、抗生素等。在污水尚未得到有效处理的情况下,水源很容易受到污染,使饮用水的安全供应面临巨大挑战;因此,研究新兴污染物对污水处理系统的影响,将为新形势下污水的有效处理提供指导。
四环素是一类水体中常见的广谱抗生素 ,它能与核蛋白体的30s 亚单位结合,阻止氨酰基trna 同核蛋白体结合,抑制蛋白质的合成。同时,四环素类yao物的广泛使用引起了四环素耐yao细菌在环境中产生并快su传播。至今,被发现的四环素耐yao细菌有115 属、530 种(抗生素抗性基因数据库http:∥ardb. cbcb. umd. edu/ )。不同来源废水中四环素的含量差异较大,一般含量在几十ng·l - 1 到几百μg·l - 1 之间。近年来,四环素对污水处理系统的影响引起了广泛关注。cetecioglu 等 在sbr 中通过测定cod 的含量和气体的产量的变化发现,当四环素投加量低于8. 5 mg·l - 1 时,反应器内底物降解作用不受影响,但产气量减小了10% ~ 20% ,说明四环素对系统中微生物造成了影响。aydin 等在asbr中通过测定甲wan产量和挥发性脂肪酸的积累量的变化发现,不同浓度组合的四环素、红霉素和磺胺对同型乙酸菌和产甲wan菌产生了不同程度的影响。aydin 等 在随后的研究中又分别运用了real-time pcr 和pcr-dgge 分子生物学技术发现,四环素、红霉素、磺胺3 种抗生素共同影响下产乙酸细菌和产甲wan古菌存在互营关系且这种互营关系对反应器的稳定运行起关键作用。
随着分子生物学技术的发展,高通量测序技术已被广泛使用在研究土壤、海洋、污水、活性污泥的群落结构中。第2 代illumina miseq 高通量测序能克服传统检测方法的缺陷,具有通量高、错误率低、成本低、流程自动化、速度快等优势 ,目前已在研究微生物多样性群落结构方面受到广泛认可 ;因此,将illumina miseq 高通量测序方法应用于污水处理系统的研究,对深入认识污水处理系统具有实际意义。
当前,污水厌氧处理因其高效能、低能耗等特点在污水处理工程上开始受到关注。它实际上是借助于不同微生物种群间的协同作用,通过水解—酸化(产氢及产乙酸)—产甲wan等一系列生物反应将有机底物转化为甲wan和无机物的过程。在这个过程中,微生物群落构成直接影响到污水处理的效果,因此,深入认识污水厌氧消化系统的微生物群落构成,对厌氧污水处理系统的稳定运行具有指导作用。
基于此,本研究通过室内模拟实验,选择abr 多相厌氧反应器进行连续流实验,启动反应器达到稳定状态后,分别在不含四环素和含有250 μg·l - 1 四环素的人工配制污水条件下运行90 d,通过考察来自反应器的氢qi、甲wan产生量的变化,运用illumina miseq 高通量测序方法对反应器中的微生物群落构成进行分析,研究四环素对污水厌氧处理系统微生物群落造成的影响,以期从微生物关系角度深入了解这种影响,为污水厌氧处理技术研究及工程实践提供参考。
1　材料和方法
1. 1　实验装置
abr 采用厚为5 mm 的有机玻璃板加工制成,尺寸为455 mm × 150 mm × 400 mm,有效容积为21l,置于(35 ± 1)℃ 的恒温箱中。反应器分为3 个格室,按照前后顺序分为格室1、格室2、格室3,分别命名为c1、c2、c3,每个格室由上、下流室(体积比为3 ∶ 1) 组成, 折流板底角为45°。格室体积比v1 ∶ v2 ∶ v3 = 1. 5 ∶ 1 ∶ 1。每个格室上部设有集气口,侧部分别设有取水口、取泥口,实验装置见图1。
1. 2　接种污泥
接种污泥取自广州市沥窖污水处理厂a2 / o 工艺的厌氧池。污泥mlss = 24. 67 g·l - 1 ,mlvss/mlss = 0. 61,ph = 6. 58,含水率为97. 30% 。接种污泥体积为反应器有效容积的1 /3。
1. 3　实验用水
配水以葡萄糖为碳源,nh4 cl 和kh2 po4 分别为氮源和磷源,同时加入ca、mg、fe、co、ni 等微量元素,以保证微生物细胞合成的需要。此外,向配水中投加一定量的nahco3 以保证abr 内的缓冲能力。
反应器以连续流方式进水,水力停留时间(hrt)为24 h。在启动阶段,采用逐步增加进水负荷的启动方式,进水cod 浓度为500 ~ 2 000 mg·l - 1 ,当cod 去除率稳定在80% 以上、出水各项指标(ph、碱度、vfa)趋于正常,启动阶段完成。反应器的运行先后经历了启动阶段(56 d)、稳定运行阶段(90 d)、添加四环素(250 μg·l - 1 )运行阶段(90 d)。
1. 4　dna 的提取和pcr 扩增及其微生物多样性数据分析
分别在反应器的稳定运行阶段和添加四环素运行阶段每间隔18 d 从每个格室采集一次活性污泥样本,分别命名为ctrl d18c1、ctrl d36c1、ctrl d54c1、ctrl d72c1、ctrl d90c1、tre d18c1、tre d36c1、tred54c1、tre d72c1、tre d90c1,其中“ctrl”代表未添加四环素运行时的污泥样本,“tre”代表添加四环素运行时的污泥样本,“d18”代表第18 天取样,“c1”代表样本取自格室1,格室2 和格室3 的样本命名为c2和c3。实验共从3 个格室中共采集到30 个活性污泥样本。分别称取0. 4 g 污泥用于dna 提取。采用mobio powersoil dna isolation kit dna 提取试机盒进行dna 提取,提取步骤依据说明书操作,提取好的dna 保存于- 20 ℃ 冰箱。
以提取的基因组dna 作为模板,使用16s rrna 基因v4 区特异性引物f515 和r806 进行pcr 扩增,扩增片段长度约为300 bp。本实验采用50 μl 的pcr 反应体系:1 μl 模板,各1 μl 的10 μmol·l - 1正向引物和反向引物(华大),0. 2 μl 20 mg·ml - 1 的蛋白质(takara),25 μl 的premix ex taq version(ex taq version 2. 0 plus dye)(takara),21. 8 μl 灭菌水(takara)。pcr 的反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,31 个循环;72 ℃ 10 min。将各样品的pcr 产物按照等摩尔量进行混合,使用qiaquick gel extraction kit (qiagen,chatsworth,ca,usa)凝胶回收试ji盒切胶回收pcr 混合产物,并用1% 的琼脂糖凝胶电泳检测,最后使用illumina miseq 高通量测序平台进行基因测序。
测序结束后,首先,使用trimmomatic (version 0. 33)软件去掉序列3′端连续的低质量碱基。接着,用mothur (version 1. 35. 1)中的“make. contigs”命令将两端reads 拼接成完整的目的dna 片段,再用“screen. seqs”,“trim. seqs” 命令进行错误序列的识别和修剪。最后,使用qiime 软件对测序数据进行微生物的多样性分析,将得到的序列进行聚类,将97% 相似性的序列聚类成为otus (operational taxonomic units)。物种分类由uclust (version 1. 2. 22)软件 和greengenes otu 数据库(gg_13_8_otus) 实现。
1. 5　反应器气体产生的分析
于固定时间每6 d 测定一次格室内产生气体中氢qi和甲wan的含量,检测方法为气相色谱法。使用仪器为安捷伦7820a 气相色谱仪,检测器为tcd,色谱柱为tdx-01,色谱条件如下:进样口、色谱柱、检测器的温度分别为100、100 和200 ℃ ;载气为氮qi,流量为35 ml·min - 1 ;进样量为1 ml。
2　结果和分析
2. 1　四环素对反应器内气体产生的影响
abr 3 个格室中氢qi的产生情况如图2 所示。仅在格室1 中检测到氢qi的存在,而格室2 和格室3中没有检测到氢qi的产生,这主要是由于格室1 进行的是产氢产乙酸反应,而后端格室主要进行的是产甲wan反应。未添加四环素运行时,格室1 内氢qi的平均产量为0. 010 2 l·(g·d) - 1 (以mlss 计)。添加四环素后,氢qi产量是未添加四环素时氢qi产量平均值的4. 05 ~ 6. 89 倍。说明四环素的添加能使氢qi产量增加。
abr 3 个格室甲wan产生情况,如图3 所示。在未添加四环素时,格室1、格室2、格室3 的甲wan平均产量分别为0. 320 4、0. 146 2、0. 088 1 l·(g·d) - 1(以mlss 计)。显然,甲wan产量在纵向上呈降低的趋势。这与反应器内的底物分配有关,格室1 进水有机物含量较高,随着格室内微生物的降解作用,有机物含量在纵向上随着格室逐渐降低,有机物的减少使得甲wan产量在格室间纵向减小。添加四环素后,格室1、格室2、格室3 的甲wan产量随着运行时间的推移呈现不同程度的下降,分别是未添加四环素时对应甲wan平均产量的43. 90% ~ 80. 20% 、27. 18%~ 79. 79% 、38. 24% ~ 83. 70% 。通过对比四环素添加后同一个格室不同时间的甲wan产量变化,发现甲wan产量随着运行时间的推移呈现下降趋势,说明四环素对产甲wan的抑制作用随着时间的推移增大。
2. 2　微生物丰度分析
通过反应器中获取的dna 序列与greengenesotu 数据库进行比对,得出反应器中微生物主要有16 个属,如图4 所示。分别为甲wan杆菌属( methanobacterium)、密螺旋体属(treponema)、寡养单胞菌属(stenotrophomonas)、不动杆菌属(acinetobacter)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)、长绳菌属( longilinea)、丛毛单胞菌属( comamonas )、互营杆菌属( syntrophobacter)、梭菌属(clostridium)、浮霉状菌属(planctomyces)、blvii28、paludibacter、authm297、wchb1-05、a17、w22。
由图4 可知,随着四环素的添加,不同物种呈现出不同的变化趋势。其中,随着四环素的添加,密螺旋体属(treponema)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)、互营杆菌属(syntrophobacter)、w22 的丰度在3 个格室内均呈现增长的趋势,说明密螺旋体属(treponema)、互营杆菌属(syntrophobacter)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)、w22 对四环素具有一定耐yao性。
密螺旋体属(treponema)能利用氢qi和二氧化碳转化成乙酸。添加四环素后,如表1 所示,格室1、格室2、格室3 内的密螺旋体属(treponema)分别是未添加四环素时相应密螺旋体属(treponema)平均丰度的1. 09 ~ 2. 00 倍、1. 27 ~ 1. 79 倍、1. 41 ~ 6. 52 倍,密螺旋体属(treponema)丰度的增加说明四环素的添加能促进氢qi和二氧化碳转化成乙酸的过程,有利于乙酸的积累。有研究表明,乙酸是微生物燃料电池生产电能的首xuan底物,1 t 生物质可产出价值150 美元的乙酸,却只能产出31 美元的甲wan;因此,在处理四环素污水时,可以充分利用密螺旋体属(treponema)的优势,增加乙酸积累,可以通过耦合系统将乙酸转化为微生物燃料电池能源或作为发酵工业的原料,实现资源回收。
互营杆菌属(syntrophobacter)是一类产氢产乙酸细菌,能将高级脂肪酸和醇类氧化分解为乙酸和h2 。
添加四环素后,如表1 所示,除了格室1 第18 天和格室3 第54 天的互营杆菌属(syntrophobacter)比未添加四环素时平均丰度低,这可能是由于反应器运行过程中其他条件扰动引起的,其他时间内格室1、格室2、格室3 内的互营杆菌属(syntrophobacter)分别是未添加四环素时相应互营杆菌属(syntrophobacter)平均丰度的1. 37 ~ 2. 04 倍、1. 00 ~ 3. 95 倍、1. 48 ~ 2. 98 倍,互营杆菌属(syntrophobacter)丰度的增加说明四环素的添加有利于产氢过程,与2. 1 中氢qi产量增大的结论相印证。氢qi是一种清洁能源,具有燃烧热值高、燃烧产物无污染的特点,具有很好的应用价值;因此,在处理四环素污水时,可以加强氢qi的回收利用,减小污水处理成本。

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